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上海邦景實業(yè)有限公司
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PCR反應(yīng)體系內(nèi)部因素
2025-5-6 閱讀(25)
一個PCR反應(yīng)過程分為很多的步驟，包括樣本采集，運輸，核酸提取，qpcr擴增等步驟，因此結(jié)果會受到很多因素的影響，本文將常見因素分為內(nèi)部因素和外部因素，內(nèi)部因素是指正常試劑體系中的成分，外部因素是指環(huán)境或者樣本帶入的因素。
體系內(nèi)部因素:
1、引物：長度、擴增跨度、特異性等因素；
2、酶及其濃度：酶濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少；
3、dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成體系需將其調(diào)節(jié)至7.0-7.5，正常情況下4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，如果其中某一種過高就會引起錯配，濃度過低又會引起PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。不過目前使用的都是商品化配置好的預(yù)混液體系；
4、模板核酸：模板核酸的量和純度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對于RNA模板更要注意RNA的降解；
5、Mg2+濃度：主要影響PCR擴增的特異性和產(chǎn)量，Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增，濃度過低會降低Taq 酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少；
6、溫度與時間的設(shè)置：變性溫度與時間、退火溫度與時間、延伸溫度與時間；
7、循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般溫度循環(huán)次數(shù)在30-40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量就越多。
