為滿足研究者研究活細胞內(nèi)溶酶體生成和功能的動力學特征，特此開發(fā)Lysosensor探針，一種區(qū)分酸性細胞器的熒光pH指示劑。該系列染料屬于向酸性探針，由于質子化聚集在酸性細胞器上。這一質子化也使得因弱堿性側鏈而封閉熒光的探針得以熒光釋放，促使熒光信號增強。
LysoSensor Yellow/Blue DND-160 黃/藍色溶酶體熒光探針
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
LysoSensor Yellow/Blue DND-160 | MX4316-50UL | 50µl | 583 |
產(chǎn)品描述
為滿足研究者研究活細胞內(nèi)溶酶體生成和功能的動力學特征，特此開發(fā)Lysosensor探針，一種區(qū)分酸性細胞器的熒光pH指示劑。該系列染料屬于向酸性探針，由于質子化聚集在酸性細胞器上。這一質子化也使得因弱堿性側鏈而封閉熒光的探針得以熒光釋放，促使熒光信號增強。因此，LysoSensor探針遇酸后熒光信號呈現(xiàn)pH依賴性的增強。
LysoSensor Yellow/Blue DND-160（黃/藍色溶酶體探針）是一種獨*-特的比率型探針，呈現(xiàn)pH依賴性的雙激發(fā)和雙發(fā)射光譜峰（見Fig 1）。然而，活細胞中這一探針僅呈現(xiàn)pH依賴的雙發(fā)射光譜（發(fā)射波長比率~450/510 nm，激發(fā)波長~365 nm）。在酸性細胞器中，LysoSensor Yellow/Blue DND-160主要呈現(xiàn)黃色熒光，而在酸性偏低的細胞器中具有藍色熒光。雙發(fā)射波長的測定允許比率成像分析在酸性細胞器比如：溶酶體或精子頂體內(nèi)的pH。其pKa值約為4.2。LysoSensor Yellow/Blue DND-160，常常簡寫成PDMPO，普遍用作海洋硅藻中二氧化硅沉積和運輸?shù)囊环N示蹤劑。
Fig 1. LysoSensor Yellow/Blue DND-160的pH依賴性光譜反應圖（A）熒光激發(fā)光譜（B）熒光發(fā)射光譜。
本品為DMSO儲存液，濃度為1mM。用于活細胞的溶酶體染色，建議工作濃度為≥1µM，需根據(jù)實際情況做優(yōu)化調(diào)整。
產(chǎn)品特征
1） 外觀：溶液
2） 濃度：1mM in DMSO
3） 亞細胞定位：溶酶體
4） 顏色：黃色、藍色
5） 檢測儀器：熒光顯微鏡
6） Abs（nm）：329，384nm [雙吸收波長，對pH敏感，見Fig 1]
7） Em（nm）：440，540nm [雙發(fā)射波長，對pH敏感，見Fig 1]
保存與運輸方法
保存：≤-20oC避光干燥保存，收到貨至少12個月有效。
運輸：冰袋運輸。
注意事項
1） 整個染色過程中需注意避光。
2） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡單低速離心使溶液降至管底。第一次使用請將本品按單次用量分裝保存，≤-20°C避光干燥保存，盡量避免反復凍融。工作濃度需根據(jù)不同的實驗要求、細胞類型、細胞或組織的膜通透性等進行優(yōu)化。
1. 工作液的配制
利用生長培養(yǎng)基或合適的緩沖液將 1mM 儲存液稀釋至工作濃度，工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用。對于 Lysosensor系列溶酶體探針，推薦工作液濃度≥1µM；
【注意】：
1）為了降低探針加載過度可能引起的假陽性，建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。
2）若細胞在染色后于不含染料的培養(yǎng)基中孵育，會觀察到熒光信號的衰減和細胞的空泡化現(xiàn)象。
2. 染色步驟（貼壁細胞）
1）將細胞置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，加入合適培養(yǎng)基，使其爬片生長。
2）待細胞生長到合適密度，吸除培養(yǎng)液，加入適量 37℃預熱的含探針培養(yǎng)基（必須完*-全覆蓋住細胞），在適合特定細胞類型的生長條件下孵育細胞30min-2h（具體孵育時間需根據(jù)細胞類型而定）。
3）利用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換上述染色液，并且用裝有合適濾片的熒光顯微鏡進行觀察。若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間，使得染料能聚集在溶酶體上。
3. 染色步驟（懸浮細胞）
1）離心沉淀細胞，吸除上清。
2）利用適量 37℃預熱的含探針培養(yǎng)基重懸細胞，在適合特定細胞類型的生長條件下孵育細胞30min-2h（具體孵育時間需根據(jù)細胞類型而定）。
3）離心，吸除染色液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。
4）用裝有合適濾片的熒光顯微鏡進行觀察。若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間，使得染料能聚集在溶酶體上。
【注意】：
另一種方法，懸浮細胞可能會粘附到經(jīng) BD Cell-Tak 處理的蓋玻片上，此時，可用類似于貼壁細胞的方法進行染色。
附錄I 溶酶體探針總表
貨號 | 名稱 | Abs (nm)[1] | Em(nm)[1] | pKa |
MX4320-50UL | LysoTracker Blue DND-22 藍色 | 373 | 422 | N/A |
MX4318-50UL | LysoTracker Green DND-26 綠色 | 504 | 511 | N/A |
MX4317-50UL | LysoTracker Red DND-99 紅色 | 577 | 590 | N/A |
MX4319-50UL | LysoTracker Deep Red 遠紅 | 647 | 668 | N/A |
MX4316-50UL | LysoSensor Yellow/Blue DND-160 黃/藍色 | 329，384[2] | 440，540[2] | 4.2 |
MX4321-50UL | LysoSensor Green DND-189 綠色 | 443 | 505 | 5.2 |
[1]:在水溶性緩沖液或甲醇中測定的吸收和發(fā)射波長；在細胞環(huán)境內(nèi)數(shù)值可能會有些許差異。 [2]:雙吸收和發(fā)射波長，對pH敏感。 |
溶酶體系列探針常見問題
1. 如何選擇合適的溶酶體探針？
答：對于溶酶體定位實驗，請選擇Lysotracker系列探針，根據(jù)自身的實驗體系，結合lysotracker系列探針的熒光特征，選擇合適激發(fā)和發(fā)射波長的熒光探針。Lysotracker Blue DND-22（MX4320-50UL）探針的光量子產(chǎn)率偏低，建議在非熒光選擇受限的情況下，推薦選擇其他幾款Lysotracker探針。對于酸性細胞器（比如溶酶體）的pH測定實驗，請選擇Lysosensor系列探針。
2. 溶酶體探針染色后是否能做固定？
3. 溶酶體探針是否能用于流式分析和熒光光度計分析？
4. 溶酶體探針LysoTracker Green DND-26（MX4318-50UL） 和LysoSensor Yellow/Blue DND-160
（MX4316-50UL）的建議孵育時間多少？
LysoSensor Yellow/Blue DND-160生化試劑
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