ELISA試劑盒操作流程

ELISA試劑盒操作流程如下：
 （1）待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl，每種樣品設3個平行孔；設兩個陰性對照孔，每孔加未處理組的細胞裂解液100μl；另設一個空白對照孔，加入純細胞裂解液100μl。　

 （2）酶標板置4℃，包被過夜。
 （3）洗板：吸干孔內反應液，用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去），之后將洗滌液注滿板孔，浸泡1-2分鐘，間歇搖動。甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。
 （4）陰性對照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
 （5）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。
 （6）洗板，同（4）。
 （7）每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。
 （8）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。
 （9）洗板，同（4）。
 （10）每孔加TMB顯色液 100μl，輕輕混勻10s，置37℃暗處反應15-20min。
 （11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。
 （12）分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui終測得的OD值為兩者之差（W1-W2），以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。ELISA試劑盒
 （13）數據處理：在得出標本（S）和陰性對照（N）的 OD值后，計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。
注：所用溶液配方
 （1） PBS：稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl，加雙蒸水至1000ml。
 （2）包被緩沖液：稱取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3，加雙蒸水至 1000m1。
 （3）洗滌液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS。
 （4）稀釋液：含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，主要用以稀釋抗體、標準品、樣品。
 （5）TMB顯色液：稱取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g檸檬酸，加雙蒸水至1O0ml，配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用10.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解1錠TMB，再加入35μl 3% H2O2
 （6）細胞裂解液：1% TritonX-100，137mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，pH 7.4。（其中PMSF溶于異丙醇中，配成1O mmo/L，-20℃ 貯存備用。
ELISA試劑盒