通蔚實(shí)業(yè)ELISA試劑盒分析葉綠素含量測(cè)定步驟

葉綠素（chlorophyll)是一類(lèi)與光合作用(photosynthesis)有關(guān)的zui重要的色素。光合作用是通過(guò)合成一些有機(jī)化合物將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的過(guò)程。葉綠素實(shí)際上存在于所有能營(yíng)造光合作用的生物體，包括綠色植物、原核的藍(lán)綠藻（藍(lán)菌）和真核的藻類(lèi)。葉綠素從光中吸收能量，然后能量被用來(lái)將二氧化碳轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔铩?br />原理
根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的zui大吸收峰。
材料、儀器設(shè)備及試劑
材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。
儀器設(shè)備：
1. 分光光度計(jì)
2. 電子頂載天平（感量0.01g）
3. 研缽
4. 棕色容量瓶
5. 小漏斗
6. 定量濾紙
7. 吸水紙
8. 擦境紙
9. 滴管

試劑：
96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。

實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2. 稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，zui后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。zui后用乙醇定容至25ml，搖勻。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95％乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm下測(cè)定吸光度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：
將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.9665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。zui后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：
葉綠素的含量（mg/g）= [葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重（或干重）。