盡管如此，作為一項免疫檢驗技術，ELISA酶免疫試劑盒試驗還是有其局限性的，不但所檢測的生物學體液樣本如血清中有可能存在各種干擾實驗的因素，而且在實驗過程中，影響結果的因素也很多，尤其是進行手工的ELISA測定時。
此外，在定性ELISA測定中，陽性判定值（CUT-OFF）的建立，是在一定的統計學基礎上的，相對于某個具體的受檢者來說，其有可能并不具備正確性。例如，使用ELISA方法檢測抗HCV及抗HIV或HBsAg，有時候，檢測所得的陽性結也許并不是真正的陽性，而需要使用其他方法如重組免疫印跡（recombinantimmunoblotas—say，RIBA）、蛋白印跡（Westernbl。t，WB）或中和試驗來確認，才能報告陽性。這里抗HCV和抗HIV的檢測均使用病毒部分的基因工程抗原，其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人體后，亦或一些自身抗體，也有可能會導致假陽性反應。
HBsAg的測定主要是弱陽性的問題，這與ELISA測定的“灰區”有關系，處于cut-off值周圍亦即“灰區”的結果的可靠性通常較差，陽性當然需要確認，陰性卻也未必是真，這一點在血站篩檢獻血員血液時是非常重要的，必須引起注意，并采取適當的措施，防止此類嚴重影響人們健康的傳染性疾病經輸血傳播，本書后面的有關章還會對此問題做詳細論述。此外，免疫測定的基礎是抗原抗體的特異反應，因此，如檢測抗原，除了要求抗體（單抗或多抗）是特異的外，還要求待測抗原上必須存在有能與所用抗體結合的抗原決定簇，如果因為基因突變導致某些位點的不表達，或者結合位點因為某些原因被封閉或阻斷，都會影響抗體與抗原的結合，造成假陰性結果。
如檢測抗體，則要求所用包被抗原應盡可能包含所有的特異抗原決定簇，同時又盡可能不含有非特異的成分，這一點往往由于技術水平的限制而難以*做到，因此，從某種意義上來說，假陽性假陰性是不能*避免的，盡管通過努力，可以將其降至很低的程度。這也是建立臨床免疫檢驗方法所努力的方向。
