質(zhì)粒提取常見問題分析

常見問題
可能原因
建議解決方案
未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低
大腸桿茵老化
請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新茵落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
質(zhì)粒拷貝數(shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
菌體中無質(zhì)粒
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選所用抗生素種類和工作濃度是否正確。
堿裂解不充分
使用過多的菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，此時可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
溶液使用不當(dāng)
溶液P2和P3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫一段時間，直至溶液變?yōu)榍辶梁蟛拍苁褂谩?br />質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時）
洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。
洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到zui大洗脫效率。
洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水；洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間，當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率。
洗脫體積太小
洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過200μl，則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。
洗脫時間過短
洗脫時間對回收率也會有—定影響，洗脫時放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。
堿裂時間過長
加入溶液P2后裂解時間不應(yīng)超過5分鐘。
質(zhì)粒純度不高
混有蛋白
菌體不要過量。經(jīng)溶液P1、P2和P3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除。
混有RNA
RNase A處理不*，請減少菌體用量或加入溶液P3后室溫放置一段時間。若溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNaseA。
混有基因組DNA
加入溶液P2和P3后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時間不要超過16小時。
含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和*0。
質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式
是在質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出多條條帶，單酶切處理后可變成單一條帶。
乙醇?xì)埩?br />漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除柱中殘留液體，并晾干吸附柱。如果DNA已經(jīng)洗脫出來，可以用酒精沉淀DNA并風(fēng)干，然后再溶解。