副結核病（M.pt）ELISA試劑盒說明

副結核病（M.pt）ELISA試劑盒說明
本試劑盒僅供研究使用。
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使用目的：
本試劑盒用于測定牛血清、血漿及相關液體樣本中副結核病（M.pt）表達。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中牛副結核病（M.pt）表達。用純化的牛副結核病（M.pt）
抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中副結核病（M.pt）相結合，經洗滌除去未結合
的抗原和其他成分后再與HRP 標記的副結核病（M.pt）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體
復合物，經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸
的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），與CUTOFF
值相比較，從而判定標本中牛副結核病（M.pt）的存在與否。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液20ml×1 瓶7 終止液6ml×1 瓶
2 酶標試劑6ml×1 瓶8 陽性對照0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板12 孔×8 條9 陰性對照0.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液6ml×1 瓶10 說明書1 份
5 顯色劑A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 張
6 顯色劑B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 個
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2 孔、陽性對照2 孔、空白對照1
孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50µl。然后在待測樣品孔先
加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止
液后15 分鐘以內進行。
計算和結果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為牛副結核病（M.pt）陰性
陽性判定：樣品OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為牛副結核病（M.pt）陽性
。
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M 的硫酸，使用時必須
注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月