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        上海一研生物科技有限公司
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        馬鏈球菌馬亞種PCR檢測試劑盒實驗原理

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                                                      馬鏈球菌馬亞種PCR檢測試劑盒說明書
         
        產(chǎn)品名稱:馬鏈球菌馬亞種PCR檢測試劑盒
        英文名稱:Streptococcus equi subspecies equiPCR
        產(chǎn)品規(guī)格:50次
        運輸:低溫
        保存:負20度
        有效期:一年
        貨期:現(xiàn)貨
        特點優(yōu)勢:
        1. 特異性:
        2.   重現(xiàn)性:   
        3.   靈敏性:
        4.   實用性:
        PCR實驗方法步驟:
        方法
        1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
        10×PCR buffer                   
        5 μl     dNTP mix(2mM)             
        4 μl     引物1(10pM)                 
        2 μl     引物2(10pM)                 
        2 μl     Taq酶(2U/μl)               
        1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)  
        1 μl     加ddH2O至50 μl  
        視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
        2:調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃40s → 58℃30s → 72℃60s,循環(huán)30-35次,在72℃保7min。
        3:結(jié)束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃保存。
        4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
        產(chǎn)品僅用于科研14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
        1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
        2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
        3. 細胞上清液:16人鼻病毒16PCR檢測試劑盒3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
        4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
        5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
        需要自備的器材:
        1.產(chǎn)品僅用于科研儀器:分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器(2 µL、20
        µL、200 µL、1000 µL)。
        2.耗材:熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水
        處理的滅菌離心管、吸頭(10 µL、200 µL、1000 µL)、滅菌雙蒸水。
        特點:
        1.即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板,操作簡單,定量準確快速。
        2. 引物經(jīng)過優(yōu)化,特異性強。預期的 PCR 產(chǎn)物長度為 560 bp。
        3. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
        4. 提供陽性對照,便于分析試驗結(jié)果。操作流程:
        1.整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
        2.為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。
        3.每次實驗應該設置陰、陽性對照。
        4.試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。
        5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放。
        6.為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
        7.儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置;不同批號試劑不能混用。
        8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
        9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
        儲存條件:
        14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
        1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
        2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
        3.細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
        4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
        5.保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
        反應五要素:
         
        參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
         
        引物:引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
         
        ①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
         
        ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
         
        ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
         
        ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
         
        ⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
         
        ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
         
        ⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
         
        引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
        運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存,保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置,不要污染其他試劑。
         
         

         

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