豬細小病毒/偽狂犬野毒/圓環2型三重核酸檢測試劑盒實驗原理

                           豬細小病毒/偽狂犬野毒/圓環2型三重核酸檢測試劑盒說明書

產品名稱:  豬細小病毒/偽狂犬野毒/圓環2型三重核酸檢測試劑盒
規格:  48T/盒
分類:核酸檢測試劑盒
原理是由一對引物介導，能在動植物體外對特定基因(DNA)斷進行快速酶促擴增，經過n個熱循環擴增，擴增產物中所含特定基因數是原始模板數的(1+E)n(0＜E＜1,擴增效率＝倍，使得檢測擴增產物中的特定基因成為可能。
特異性強
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
      ④靶基因的特異性與保守性。
產品及特點 ：
聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。本產品就是為滿足這一需求根據 PCR 原理開發的產品，它具有下列特點：
1. 一管式操作，用戶只需要提供樣品即可。
2. 根據大豆熱休克蛋白基因保守區域設計引物，能專一性檢測出樣品中的大豆成分，但不能檢測其他非大豆成分。
3. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。
4. 只需要普通 PCR 儀和凝膠電泳儀，無需配置貴重儀器設備。
5. 對混合樣品中大豆成分的檢測下限為 0.1%，對樣品中大豆成分的核酸檢測下限為 1.0ng/μL。
6. 本只能用于科研，足夠 50 次 40uL 體系的常規 PCR。
 豬細小病毒/偽狂犬野毒/圓環2型三重核酸檢測試劑盒具有下列特點：
1.根據 指標的保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
2.靈敏度比常規 PCR 高 2-3 個數量級，可以達到幾百拷貝/反應。
3.即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。
4.一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6.本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規格及成分                            成分
2×qPCR MagicMix                 500 μL（裝 A 袋）
微量核酸稀釋液（熒光 PCR ）1 mL（裝 A 袋）
PCR 引物混合物                        100 μL（裝 A 袋）
基因陽性對照                           50 μL（裝 B 袋）
DNA 病毒裂解液（試用裝）       15 次（9 mL）
使用手冊                              1 份
運輸及保存：低溫運輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準備區、B 袋的陽性對照分開放置)，
自備試劑DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。
應用案例
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
 豬細小病毒/偽狂犬野毒/圓環2型三重核酸檢測試劑盒設置 qPCR 反應（20  μL 體系，在樣品制備室進行）
9.在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后*后加）：
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
10. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行
優化）。
過程溫度時間
預變性95℃1 分鐘
PCR 反應95℃15 秒
（30 個循環）60℃15 秒
72℃15 秒
11. 數據采集
具體操作按所用儀器的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時，
吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的吸收光譜在 500 nm，發射光
譜在 530 nm。
四、數據處理
12. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品
的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。