細胞傳代培養操作流程

細胞復蘇：

  1. 將新鮮培養基置于37℃水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。如配置：50mL*培養基(含10%FBS，1%青雙抗) 44.5mL基礎培養基+ 5mL FBS + 0.5mL青雙抗。

  2. 戴防護手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避冰晶重新結晶而造成細胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鐘內全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。

  3. 將解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養瓶內，再向瓶中加入10mL*培養基(稀釋比例為1:10)，混合均勻，放入37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。取0.1ml解凍胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長，可不需CO2) 

  4. 一般而言，細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離1300rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO

  2培養箱培養。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。

傳代培養：

1.37℃恒溫培養約48小時，待細胞長滿80-90%后，從培養箱取出75cm

  2培養瓶，倒掉培養基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液。

   2.沿壁（無細胞的一面）緩緩加入1mL溶液消化細胞約

1min，輕輕搖晃，倒掉殘余，將培養瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一面。

  注意：消化溫度是37℃，加液后用移液管反復吹打分散細胞。

  3.向瓶中加入5mL*培養基，反復吹打均勻2min，從中取出至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺盼藍溶液，混勻，從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數板上，計算細胞密度及活率。

   4.將5mL細胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養基瓶和另一新的培養瓶中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養基，置于CO2培養箱養。（細胞傳代時按1：5或更大比例稀釋）