雜合二倍體的形成和檢出

(1)雜合二倍體的形成和誘發(fā)雜合二倍體是由兩個(gè)不同遺傳型的單倍細(xì)胞核融合產(chǎn)生的。雜合二倍體就在異核體菌落表面上形成與異核體菌落顏色不同的角變(扇形)或斑點(diǎn)分生孢子。挑取角變或斑點(diǎn)上的孢子，進(jìn)行分離純化，可以得到純雜合二倍體的菌株。異核體自發(fā)核融合而形成雜合二倍體的頻率極低，常以人工誘發(fā)方法來提高頻率。采用天然樟腦蒸氣熏蒸或紫外線處理異核體的菌絲或者分生孢子，然后再繼續(xù)培養(yǎng)是常用的方法。

(2)雜合二倍體的檢出 雜合二倍體常常在異核體菌落上以角變或斑點(diǎn)形態(tài)出現(xiàn)，這種角變或斑點(diǎn)往往是野生型親本的孢子顏色或菌落結(jié)構(gòu)而區(qū)別于異核體。用接種針挑取它們上面的分生孢子，再用自然分離的方法進(jìn)行分離、純化，即可獲得雜合二倍體。還可以將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化．即得雜合雙倍體。由于雜合二倍體是霉菌準(zhǔn)性生殖過程中的重要組成部分，也是雜交育種的關(guān)鍵性一步。因此，獲得的純雜合二倍體菌株除了需要多次的分離、純化外，還要對(duì)它的形態(tài)、生理和遺傳等特性進(jìn)行研究，以確保不混雜其他菌株。

1.體細(xì)胞重組

體細(xì)胞重組包括體細(xì)胞交換、體細(xì)胞分離和單倍化三個(gè)階段。

(1)體細(xì)胞交換體細(xì)胞交換是指雜合二倍體在有絲分裂過程中發(fā)生染色體交換現(xiàn)象．當(dāng)雜臺(tái)二倍體細(xì)胞在繁殖過程中進(jìn)行有絲分裂，同源染色體的兩條單體間一些位點(diǎn)會(huì)發(fā)生三換，結(jié)果導(dǎo)致同源染色體上部分區(qū)段出現(xiàn)重組．產(chǎn)生新的二倍體子代。

(2)體細(xì)胞分離雜合二倍體在有絲分裂過程中，細(xì)胞核內(nèi)的同源染色體以偶然的機(jī)會(huì)發(fā)生交換，而引起局部染色體上基因種類發(fā)生變化，從而產(chǎn)生基因型不同的后代，稱為體量胞分離，其結(jié)果是產(chǎn)生多種類型的分離子。

(3)單倍化單倍化是指雜合二倍體細(xì)胞在增殖過程中借助整條染色體的隨機(jī)交換而得到單倍重組體或單倍的親本分離子。單倍化過程發(fā)生在體細(xì)胞有絲分裂時(shí)期，細(xì)胞分裂時(shí)遺傳物質(zhì)分配不均，除了產(chǎn)生正常的二倍體細(xì)胞外，還會(huì)產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞，這種細(xì)胞一般不穩(wěn)定，再經(jīng)過多次細(xì)胞分裂后，失去一些染色體而變成單倍體細(xì)胞，形成多種類型的單倍體分離子。由于這個(gè)過程不存在顯性基因，使得在分離子中顯現(xiàn)出隱性性狀。

(4)分離子 雜合二倍體經(jīng)過體細(xì)胞交換和單倍化后產(chǎn)生的子細(xì)胞，稱為分離子。分離子種類很多，根據(jù)不同情況可以分為以下幾類：親本分離子、原養(yǎng)型分離子和異養(yǎng)型分離子；二倍分離子、單倍分離子和非整倍分離子；初級(jí)分離子和次級(jí)分離子。親本型分離子的表現(xiàn)型和基因型與直接親本相同。原養(yǎng)型分離子不缺少直接親本所缺陷的性狀，基因型一般與野生型菌株類似。異養(yǎng)型分離子表現(xiàn)出直接親本所不具有的新的性狀，但仍具有直接親本的部分缺陷性狀。由雜合二倍體繁殖后*次產(chǎn)生的子細(xì)胞，稱為初級(jí)分離子，如果初級(jí)分離子或非整倍分離子再移接一代后產(chǎn)生的分離子，稱為次級(jí)分離子。

(5)分離子的檢出與測(cè)定方法盡管雜合二倍體用誘變劑或重組劑誘發(fā)，可以提高分離子產(chǎn)生的頻率，但總的來說，產(chǎn)生的分離子數(shù)量仍然很少。要想在大量的菌落中識(shí)別和檢出各種分離子，主要根據(jù)分離子攜帶的隱性標(biāo)記。

    檢出分離子常用的方法是將雜合二倍體菌落產(chǎn)生的分生孢子分離在*培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后在長(zhǎng)出的大量菌落中找到個(gè)別菌落上出現(xiàn)具有隱性標(biāo)記突變顏色的角變或斑點(diǎn)，挑取它們上面的分生孢子移接到*培養(yǎng)基斜面，進(jìn)一步分離、純化。如果要檢出抗性分離子，可將雜合二倍體孢子分離在選擇性培養(yǎng)基平板上，則可篩選出耐藥性分離子。選擇性培養(yǎng)基有兩種：一種是含有重組劑的*培養(yǎng)基，如對(duì)氟(PFA)不會(huì)引起基因突變，但能促進(jìn)體細(xì)胞重組，增加分離子的出現(xiàn)頻率；另一種是在*培養(yǎng)基中加入吖啶黃之類的藥物，因?yàn)橐粋€(gè)抗性菌株和一個(gè)敏感菌株形成的雙倍體對(duì)吖啶黃是敏感的．在這種培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，只有耐藥性分離子可以生長(zhǎng)。

    從雜合二倍體中檢出的分離子，必須進(jìn)行分離純化，然而對(duì)它們的特性進(jìn)行全面測(cè)定分析，包括菌落形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)要求、孢子顏色、孢子DNA含量以及代謝產(chǎn)物能力等。

2.高產(chǎn)重組體的篩選

    雜交育種的目的是獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定的重組體。異核體和雜合二倍體在遺傳上是不穩(wěn)定的，在繁殖過程中會(huì)發(fā)生分離現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。只有單倍重組體才是穩(wěn)定的。在進(jìn)行霉菌雜交育種時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：選擇的兩個(gè)親本菌株，不僅要具有不同的優(yōu)良性狀．而且是近親配對(duì)組合，這樣易獲得產(chǎn)量高的重組體；要用合適的誘變劑處理雜合二倍體，促使它進(jìn)行體細(xì)胞交換和單倍化過程，選出具有高產(chǎn)和優(yōu)良性狀的單倍重組體；對(duì)獲得的重組體進(jìn)行特性代謝調(diào)節(jié)，即篩選適應(yīng)酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)突變株，使高產(chǎn)重組體能夠充分發(fā)揮其高產(chǎn)潛力并能適應(yīng)工業(yè)化。