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細胞專用培養基操作步驟完成后，接下來的關鍵步驟是確保無菌操作環境下的細胞接種與培養。首先，將準備好的細胞懸液輕輕搖勻，使用移液槍吸取適量細胞懸液，避免產生氣泡，以免影響細胞分布均勻性。在顯微鏡下確認細胞狀態良好后，緩緩將細胞懸液滴加到已含有適量培養基的培養皿或培養瓶中，注意動作輕柔，以免對細胞造成機械損傷。
接種完成后，輕輕晃動培養容器，使細胞均勻分散于培養基中。隨后，將培養容器轉移至設定好適宜溫度、濕度及氣體成分（通常為37℃、5% CO?的恒溫培養箱）的培養箱中。在此階段，定期觀察細胞生長情況至關重要，可通過顯微鏡監測細胞形態、密度及是否有污染跡象。
根據細胞類型的不同，適時進行換液操作，以去除代謝產物，補充新鮮營養，維持細胞健康生長。換液時，同樣需嚴格遵守無菌操作原則，使用無菌吸管吸去舊培養基，再沿容器壁緩慢加入預熱至室溫的新培養基，避免直接沖擊細胞層。
當細胞達到預定的生長狀態或密度時，即可進行后續的細胞傳代、凍存或用于實驗研究。整個操作過程中，詳細的實驗記錄包括培養基成分、操作時間、細胞生長狀態等，以便追溯與分析實驗結果，確保科研數據的準確性和可重復性。
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