(一)試驗原理

    葡萄糖在細胞內的轉運系統(tǒng)包括細胞膜、胰島素受體和葡萄糖轉運載體等。胰島素和某些降血糖藥對該系統(tǒng)具有激活作用，可促進葡萄糖轉運，從而調節(jié)糖代謝。本實驗通過離體睹肪細胞與2一脫氧一3 H一葡萄糖或3一O一3 H一甲基葡萄糖溫孵，檢測脂肪細胞對葡萄糖的攝取情況，觀察待測藥物對其影響。

(二)材料

1．待檢藥物進行不同倍數(shù)稀釋。

2．陽性對照藥胰島素。

3．動物140～200g SD或Wistar雄性大鼠1只。

4．試劑及配制

(1)鹽貯存液：稱取NaCl 76．74 g，KCl3．51g．MgSC4·7 H20 3．63 g，CaCl2·2H2O3．63 g，溶于1000ml蒸餾水中，4℃保存(2周)。

(2)HEPES貯存液：稱取HEPES 23．8g，NaH2PO4·H2O 42g，溶于1000ml蒸餾水中，pH調至7．6(20℃)，4℃保存(2周)。

(3)10%白蛋白貯存液：稱取100g白蛋白(Ⅱ、Ⅷ型)，溶于500ml蒸餾水中，放置過夜后透析12 h(4℃)，加水至1000ml。用濾紙過濾1次后，用O．8μm微孔濾器再次過濾·應使溶液保持低溫。pH調至7，4，分裝后一20℃可存放1年以上。

(4)緩沖液：1：10鹽貯存液、l：10 HEPES貯存液、一定量白蛋白貯存液(0．5％～5％)，蒸餾水加至終體積。

(5)膠原酶緩沖液：膠原酶(Ⅱ、Ⅷ型)緩沖液含O．5mmol／L葡萄糖、3．5％BSA．濃
度為0．5 mg／ml，pH調至7．4(37℃)，一20℃可存放4周。

5．器材37℃水浴箱、電磁攪拌器、50ml塑料燒杯、300μm尼龍篩、圓底塑料試管。

(三)實驗方法

1．脂肪細胞的分離與制備

(1)斷頭處死大鼠后打開腹腔，取附睪脂肪墊，將脂肪墊用剪刀剪成I～2 min。大小置于含3ml膠原酶緩沖液(溫度不低于25℃)的燒杯中。

(2)燒杯在30℃水浴溫孵450min左右，低速攪拌l～2 min，使90％組織分散。

(3)將300μm尼龍篩折成漏斗狀，置于圓底試管上，倒人細胞后用少量緩沖液沖洗。靜置細胞l～2 min后，用長針頭吸取試管底部的細胞碎片，加入10ml緩沖液后輕輕轉動試管，去除下沉物，重復該過程3～4次。

(4)量取濃縮的脂肪細胞懸液，用緩沖液稀釋到相應濃度。

(5)用顯微鏡檢查制備好的脂肪細胞。將5μl脂肪細胞懸液稀釋25～50倍后進行細胞計數(shù)和細胞大小測量，調細胞濃度為5×106／ml亦可采用鋨酸固定后的細胞。

2．藥物對細胞毒性的測定(藥物無毒*的選擇) 采用微量培養(yǎng)法。預先將上述細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內，置37℃5％CO2孵箱內，大約24h細胞成層后，棄去孔內培養(yǎng)液。再將遞倍稀釋(1：2，1：4…1：512)的0．1ml受檢藥物，分別加入成層的HeLa細胞孔內，每孔再補加O．1ml細胞培養(yǎng)液，每個濃度4孔，同時設細胞對照孔，置37℃5％CO2孵箱內培養(yǎng)，每天記錄細胞病變結果，直至藥物對細胞的毒性不再繼續(xù)進展時判定結果，以不出現(xiàn)細胞病變的藥物zui小稀釋倍數(shù)為無毒*，計算出受檢藥的無毒*。

3．葡萄糖轉運的測定取2～4×106個／800gl脂肪細胞置于培養(yǎng)管中，37℃水浴溫孵：用生理鹽水將胰島素或待測藥物從無毒*開始稀釋成不同濃度，取4～8ul加到上述細胞懸液中。溫孵30～60min后，加80μl 2一脫氧一3 H一葡萄糖(1．22×105Bq／μmol)，使其終濃度為100μmol／L，溫孵3min。取200μl懸液，加入100“l鄰苯二甲酸二辛酯后，8500r／min離心20s，分離油相細胞層，加5ml閃爍液后計數(shù)。

    細胞外放射性沾染的排除：將L一[14C]葡萄糖加入脂肪細胞懸液中，4℃放置3min。離心后取油相細胞計數(shù)，校正后數(shù)值即為脂肪細胞對2一脫氧葡萄糖的攝取值。

(四)結果與分析

1．胰島素和某砦藥物可直接促進脂肪細胞對葡萄糖的轉運。

2．有些藥物對葡萄糖的轉運無直接作用，但與低濃度胰島素(≤1nmol／L)共同孵育，可增強胰島素促進脂肪細胞對葡萄糖的攝取作用。

3．非代謝的葡萄糖類似物3-O-3 H一甲基葡萄糖與脂肪細胞溫浴后，用快速過濾法亦可測定脂肪細胞對葡萄糖的攝取。