一、載體的構建

    外源基因往往不能獨立復制，需要與一個復制子相連接，使它能被引入宿主內并能在其細胞內復制。在重組DNA技術中擔負基因轉移任務的復制子叫載體(vector)。

一個理想的載體通常應具備下列特征。

①能在宿主細胞中獨立復制，或者能有效地協助外源基因整合到宿主染色體上，使外源基因可以隨宿主染色體一起復制。

②容易進入宿主細胞。

③有一定的選擇性標記，易于識別和篩選。

④可插入一段較大的外源DNA，而不影響其本身的復制。

⑤有合適的限制酶位點便于進行克隆。

    另外，還應具有較好的安全性、易制備、多拷貝、易于表達等特點。重組DNA技術中所用的載體主要是質粒和溫和噬菌體(見轉導)兩類。為了實現目標基因的復制和表達，宿主和載體缺一不可，而且不同的宿主需要不同的載體，兩者相輔相成，構成完整的宿主一載體系統。這里主要以大腸桿菌和酵母菌宿主為例介紹常用載體。

1. 以大腸桿菌為宿主的載體

    以大腸桿菌為宿主的體系，常用的載體有質粒載體、噬菌體載體以及由它們組合而成的復合型載體(柯斯質粒、噬菌粒)等。

(1)質粒載體質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作人工構建而成的。與天然質粒相比．質粒載體通常具有以下特點。

①帶有一個或幾個選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)。

②帶有一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列。

③去掉了大部分非必要序列，使分子量盡可能減少。

④往往還帶有一些多用途的輔助序列。

    常用的質粒載體大小一般在1～10kb，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescrjpt(簡稱pBS)系列等。以pUCl9為例，它的大小為2686bp．帶有一個復制起始位點、一個*抗性基因、一個大腸桿菌乳糖操縱子β一半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼n一肽鏈的DNA序列組成的lacZˊ基因、一個調節缸lacZˊ基因表達的阻遏蛋白(repressor)基因如lacI，以及位于lacZˊ基因中靠近5ˊ端的一段多克隆位點，在該多克隆位點插入外源基因后，將破壞lacZˊ基因，使其不能正常表達(圖6．5)。篩選含pUCl9質粒細胞的過程比較簡單：如果細胞含有未插入目的DNA的pUCl9質粒，在同時含有誘導物IPTG和X—gal底物的培養基上培養時將會形成藍色菌落；如果細胞中含有已經插入目的DNA的pUCl9質粒，在同樣的培養基上培養將會形成白色菌落。因此，可以根據培養基上的顏色反應十分方便地篩選出重組子。一個與pUCl9質粒十分類似的質粒是pUCl8，兩者的差別僅在于多克隆位點的插入方向彼此相反。

(2)噬菌體載體 重組DNA技術中常用的噬菌體載體主要有x噬菌體和一些單鏈DNA噬菌體(如M13噬菌體)。

    野生型的λ噬菌體DNA含有多個常用限制酶切點，不宜作為載體。經過研究人員的多年努力，目前已經成功地構建了多種λ載體，這些載體可分為兩類。

①插入型載體(insertion vector)，它具有單一的酶切位點，可供外源DNA的插入。

②置換型載體(replacement vector)，它具有成對的酶切位點．兩個酶切位點之間的DNA片段可被外源DNA片段置換。

    由于λ噬菌體顆粒有效包裝DNA的長度范圍為野生型長度的78％～105％，也就是38～52kb，而λ噬菌體裂解生長必需基因組就占了28～30kb，岡此可克隆的zui大外源DNA長度約為24kb。一般插入型載體可克隆的zui大外源DNA長度在10kb以下，而置換型載體可克隆的外源DNA長度在9～24kb之間。λ噬菌體載體在DNA文庫的構建中非常有用。

    在大腸桿菌中，還存在一類絲狀噬菌體，如M13、fl和fd等，其噬菌體顆粒中包裝的是單鏈(正鏈)的DNA。這類特殊的噬菌體在分子生物學中具有*的地位。現在，M13噬菌體已經被發展成為一種通用的克隆載體。與上述載體相比，M13噬菌體載體的一個突出優點是，可以方便地獲得含目的基因的單鏈DNA。這種單鏈DNA可廣泛應用于核苷酸序列測定、探針制備和寡核苷酸定點突變等。

(3)柯斯質粒(cosmid) 柯斯質粒，又稱黏粒，是由大腸桿菌質粒中插入λDNA的包裝識別序列cos位點構建而成。它是一種特殊的質粒載體。大多數常用的柯斯質粒載體大小約為6kb，因此它可克隆的外源DNA片段長32～46kb，比λ 噬菌體載體可克隆的片段大了約一倍。柯斯質粒同時具有質粒和x噬菌體載體的某些特性。

(4)噬菌粒(phagemid) 另一類由質粒和噬菌體組合而成的特殊質粒載體稱為噬(菌)粒。噬菌粒是以普通質粒載體與絲狀噬菌體M13或f1等為基礎構建的，在質粒中插入了包括絲狀噬菌體DNA合成起始和終止的順式作用信號及絲狀噬菌體顆粒裝配所需的序列等絲狀噬菌體主要基因，它同時具有質粒和絲狀噬菌體的特征，因此稱為噬(菌)粒(phagemid或phasmid)。與M13噬菌體載體相比，噬菌粒分子量小、克隆能力大、遺傳也更穩定。與普通的質粒載體相比，噬菌粒的主要優點是容易得到單鏈DNA。由pUCl8／19質粒發展而來的pUCll8／119質粒就是典型的噬菌粒載體。

(5)大容量克隆載體 細菌人工染色體(bacterial artificial chlromosome，BAC)是以大腸桿菌致育因子(F因子)為基礎構建的合成載體，含F因子復制的起始基因和定向基因(oris和repE)。其特點為：拷貝數低，穩定，克隆的外源DNA的平均大小約120kb，個別BAC可克隆zui大達300kb的基因組DNA。BAC可以通過電穿孔導人細菌細胞，其不足之處是對無選擇性標記DNA的產率很低。P1人工染色體(P1 artificial chlromosome，BAC)是結合BAC和P1噬菌體載體的優點而開發的克隆體系，可以包含60～150kb的外源DNA
片段。

(6)表達載體根據載體的不同用途，還有克隆載體和表達載體之分。克隆載體是指以繁殖DNA片段為目的的載體。這種載體一般本身較小，但可攜帶較大的外源DNA片段．在細胞內的拷貝數較高。表達載體則是用來將克隆的外源基因在寄主細胞內表達成蛋白質的載體。

    大腸桿菌表達載體通常具有強而可控的啟動子、轉錄終止子、翻譯起始序列、翻譯增強子和翻譯終止子等與基因表達有關的序列。其中啟動子是決定基因表達水平的關鍵因素。也是構建表達載體時優先考慮的環節．表達載體的啟動子應在宿主中具有很強的啟動效率。大腸桿菌表達載體常具有大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動子、*操縱子的trp啟動子、λ 噬菌體的PL啟動子或者一些復合啟動子等。其次，有些表達載體自身不帶抑制物基因，使用這類載體時選擇能產生抑制物蛋白的宿主菌，否則目的基因的表達不能調控，不利于表達。另外，用表達載體獲取蛋白質產物時還要考慮宿主菌是否合適，因為很多宿主菌往往含有蛋白酶，會對表達產物產生降解作用。因此，用作基因表達的宿主菌一般都要經過改造，使其蛋白酶基因缺失或失活，以便于表達產物的積累。