熒光標記原位雜交法(fluorescence in situ hykbridizatlon，FISH)是近年發展起來的非放射性標記新技術。FISH可檢測單拷貝基因、表達mR>JA等；其有無毒性、快速、分辨率高等優點，獲得廣泛的應用。

(一)原理

    熒光標記原位雜交是利用基因探針在組織切片、細胞或染色體上進行分子雜交的方法。先把17NA探針借缺口翻譯標記在適當半抗原如*dUTP上，與染色體或組織切片標本雜交。然后使dUTP與抗體／熒光素復合體進行反應和結合，便可在鏡下顯現熒光并被觀察到。FISH法已廣泛應用到染色體基因定位、細胞中RNA或病毒DNA的檢測。FISH其有操作方便，敏感、簡便、安全、實用，特別是可用多種顯色，對確定染色體基因結構的分析是十分有用的手段。由于可在組織切片或細胞上檢測基因的拷貝數或基兇的表達狀況，因此這一技術在臨床疾病診斷方面有好的應用前景。

(二)方法

原位雜交的主要技術：細胞準備、組織標本制備、探針標記、雜交和洗片、探針雜交信號的顯示等幾步組成，分述如下：

1．標本制備

(1)按常規方法制備染色體滴片標本，室溫下干燥后置真空干燥容器內儲存。使用時先在56℃干烤過夜；

(2)培養細胞標本制作與染色體方法相同(亦可用按常規法制備的組織病理切片標本)：

2．探針標記

用*標記DNA探針：按Oncor缺口翻譯試劑盒操作，取：

DNA(μg／μl)        1．0μl

核酸緩沖液(10×) 10．Oμl

DNA聚合酶          5．Oμl

雙蒸水                34μl

混勻后置15℃水浴中，溫浴2．5h，然后加終止反應液(10mmol／L EDTA，0．1％SDS)lOμl，置冰上。

3．探針的純化

(1)取1 ml一次性塑料注射器，用少許玻璃棉堵住注射器的下口，用尖吸管將Sepha—dex G一50裝入注射器(避免產生氣泡)，即成為純化探針的柱子。取一個15ml離心管，將1．5ml小離心管去蓋后放人到15m1離心管底部，并將制備好的柱子放人到離心管內。

(2)將制備好的柱子連同15m1離心管放人離心機中，在室溫25℃，1000r／min離心5min。

(3)另取一15ml離心管，在底部放入一個新的1．5ml離心管(去蓋)，將制備好的柱子放人離心管中。

(4)將標記好的反應物50μl加入到柱子上端，室溫下(25℃)1500r／mm離心5min，再加30μl雙蒸水按上述條件離心。

(5)離心后，把收集到的溶液進行定量并將總體積調至100μl，避光放在一20℃保存，一般可存放6個月。

4．雜交和洗片

(1)用RNase處理玻片：將鋪有染色體或細胞的玻片放入含有100μg／μl RNase-的溶液中處理60min(37℃)，然后用2×SSC室溫洗4遍，每遍2min。用70％、80％、95％冷乙醇在一20℃中進行脫水，每次2min，室溫下干燥；

(2)標本變性：將脫水后的玻片放入變性液(4ml 20×SSC、8ml雙蒸水、28ml甲酞胺)，在70℃中變性2min。

(3)快速轉移到冷的70％乙醇中，作用2min，然后用乙醇依次脫水(80％、95％、100％)，在20℃中進行，每次2min，室溫下空氣干燥。

5．雜交

(1)加入雜交液前，把玻片放在一個小盒內，盒的下層有少許水，以保持玻片有一定濕度，在37℃恒溫30min。

(2)探針變性，取1．5μl*標記的DNA探針(10ng／μl)加入到30μl閃雜交液中(5×SSC，50％甲酞胺)混勻后放入70℃水浴變性5min，然后迅速放人冰上冷卻后加到玻片上(每張玻片30μl)，用蓋玻片蓋好，放人培養小盒，置37℃培養4～16h。

6．洗片雜交后玻片，小心去除蓋玻片，放入清洗溶液中(4ml 20×SSC，16m1雙蒸水．20ml甲酞胺)在43℃中洗20min。然后用20×SSC，37℃洗2遍。放入1×PBD溶液中(玻片在4℃可保存2周)。

7．雜交信號顯示和放大

(1)將玻片從1×PBD溶液中取出。平放在玻片架上，加60μl封閉液l用石蠟膜蓋好，室溫下作用5min。

(2)去掉石蠟膜，加60μl熒光標記Avidin溶液，37℃作用20min。

(3)在1xPBD溶液中洗片3次，每遍2min。

(4)雜交信號放大：在玻片上加60μl封閉液2，室溫下作用5min，加抗Avidin的抗體．37℃作用20min。

(5)用lx PBD洗片3遍，每遍2min(室溫)，加終止液1．60μl，室溫下作用5min，加熒光標記Avidin，37℃作用20min，用1×PFD洗3遍。

(6)染色體顯色，在玻片上加18μl Propidium Ivdine加antirade，室溫下反應5min，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

(三)注意事項

    FISH實驗中zui常見的問題是雜交后沒有信號或本底過高。雜交沒有信號，往往是由于振針本身或標記不好所致，本底過高的解決辦法除改善雜交條件外，洗片時可增加強度，如增加溫度或降低鹽濃度。實驗中的器皿要保持清潔，并盡可能高壓滅菌。