細胞生長曲線(cell growth cilrve)是測定細胞增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法，是研究細胞在一代生存期內(nèi)的增殖過程的重要指標。常用方法有細胞計數(shù)法。它以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標。細胞生長曲線可用于分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的時間。細胞增殖曲線的測定一般可利用細胞計數(shù)法進行。

一、細胞計數(shù)法

(一)材料

1．待測細胞懸液。

2．24孔培養(yǎng)板。

3．消化液：O．25％*和O．0256 EDTA混合消化液。

(二)方法

1．培養(yǎng)細胞取生長狀態(tài)良好的細胞，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度后，在培養(yǎng)板的21個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞(如果使用培養(yǎng)瓶，則需接種21瓶)。接種時間記為0h。

2．計數(shù)細胞密度從接種時問起，每隔24h吸棄3孔中培養(yǎng)液，加入消化液，混懸細胞并計數(shù)3孔(瓶)內(nèi)的細胞密度，求平均值。為提高準確率，對每孔(瓶)細胞可計數(shù)2～3次。如此操作至第7d結(jié)束。

3．繪制曲線以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，標出各點并連成線，即得所培養(yǎng)細胞的增殖曲線。

(三)結(jié)果分析

    細胞增殖曲線反映細胞的生物學特征，標準的曲線呈近似“S”形。每一代細胞的生長過程可大致分為潛伏期、對數(shù)生長期和停滯期。一般在傳代后*天細胞數(shù)有所減少，經(jīng)過幾天的潛伏適應期后進入對數(shù)生長期，達到平臺期后生長穩(wěn)定，zui后到達衰老。

1．潛伏期是細胞對分離和傳代操作所致的損傷的恢復以及適應新生長環(huán)境的過程。原代培養(yǎng)細胞需要24～96h。，甚至更長時間才能恢復增殖。不同細胞的增殖恢復所需的時間不同，如腫瘤細胞比二倍體細胞恢復得快。傳代細胞的潛伏期一般為6～24h。

2．對數(shù)生長期細胞數(shù)量呈對數(shù)增長，對數(shù)生長期一般為3～5d，常以倍增時間(即生長曲線上細胞數(shù)量增加一倍的時間)來表示細胞生長旺盛情況。細胞生長倍數(shù)則是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到zui大活細胞濃度的比率。細胞傳代、指標測試等多在此區(qū)間進行。

3．停滯期細胞不再增殖，生長活動停滯。

(四)注意事項

1．培養(yǎng)板各7L內(nèi)細胞的消化操作過程要一致，以免造成細胞濃度的明顯差別。

2．計數(shù)前，應盡量使細胞混懸均勻。每孔內(nèi)加入的細胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。

3．細胞接種數(shù)量應適宜。一般接種數(shù)量以7～10d能長滿而不發(fā)生生長抑制為宜。數(shù)量過少將導致細胞適應期延長，數(shù)量過多易使細胞快速進入增殖穩(wěn)定期。

4．細胞增殖曲線可有20％～30％的誤差，需較反映生長數(shù)值時，需結(jié)合其他指標進行分析。

二、WST一8檢測法

    WST-8是一種新型的水溶性四唑鹽，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成具有高度水溶性的橙黃色甲臌產(chǎn)物，其顏色的深淺和活細胞的數(shù)量呈正比。含WST一8成分的CCK 8(cell counting kit一8)試劑盒已廣泛應用于檢測細胞增殖和細胞毒性。其檢測方法簡單介紹如下：

(一)材料

1．待測細胞。

2．96孔培養(yǎng)板。

3．10％FBS培養(yǎng)溶液。

4．CCK 8試劑盒。

5．酶聯(lián)免疫檢測儀。

(二)方法

1.96孔板中每孔加入200 μl含10％FBS的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，并進行實驗分組。

2．每隔24h酶聯(lián)免疫儀測定各組細胞在450nm波長處的吸光度值，連續(xù)監(jiān)測7次。

(三)結(jié)果分析

    計算各個實驗分組的吸光度值的平均值，設(shè)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

(四)注意事項

    為了獲得更為可靠的實驗數(shù)據(jù)，應至少重復3次實驗，以提高實驗結(jié)果的可靠性。