化學致癌物誘導細胞轉化實驗

(1)原理：化學致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化學物質引起或誘導正常細胞發生惡性轉化并發展成腫瘤的過程。通過細胞表型的改變，反映各種理化因素的致癌性，同時，可模擬化學致癌物在體內致癌的過程，并可對發生轉化的細胞做直接觀察和各種分析。其中以敘利亞地鼠胚胎初代培養細胞較為常用，現在以N一甲基一N'一硝基一N一亞硝基胍(MNNG)進行細胞轉化實驗為例。

(2)材料

1)動物：鼠(如：敘利亞地鼠，金倉鼠等)。

2)細胞生長液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養液。

3)維持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養液。

4)消化液：O．25％*(含O．01％EDTA)。

5)凍存液：含lO％小牛血清的DMSO。

6)致癌劑：MNNG。

7)洗液：PBS。

(3)方法

1)取材：妊娠第13天鼠，取數個同窩胚胎，去頭和內臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0．25％*(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，濾過，低速離心，吸除消化液，加入營養液制備成細胞懸液，接種人75cm培養瓶中，接種密度為10～20×106／75 cm，37℃培養2～3d。

2)貯存：選大批生長狀態良好的細胞凍存。

3)致癌物處理：取凍存細胞，解凍后接種于25ml培養瓶中，每瓶含細胞10萬～30萬。待細胞生長進入指數增生期時，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培養基，在37℃孵箱中培養12～48h。

4)低血清培養：棄掉MNNG致突變劑，用溫PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，繼續置溫箱中培養2～3周，然后改用含5％血清培養液培養。低血清培養液不利于正常細胞牛長，但已轉化的細胞仍能增殖和形成轉化灶。

5)轉化灶的形成：用致癌物處理過的細胞于10d后在正常細胞之間，可產生數量不等的轉化灶。轉化灶由密集而重疊的細胞組成。在透光檢查時，肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉化灶。顯微鏡下觀察，未轉化的成纖維細胞轉化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉化灶邊緣，轉化細胞與正常細胞界限分明，形態區別相當明顯。上皮細胞轉化后形態變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。

6)轉化細胞的分離：將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察轉化細胞，將轉化灶用記號筆標記。用細胞刮去除未發生轉化的外圈正常細胞。向瓶內加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化數分鐘。鏡下觀察細胞變圓時，加人含10%小牛血清的*培養液，反復用吸管吹打分散，制成細胞懸液，分瓶培養。成單層后，再用傳代法擴大培養。

(4)轉化細胞觀察與鑒定：轉化灶由密集而重疊的細胞組成。肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉化灶。顯微鏡下觀察，成纖維細胞轉化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性．失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉化灶邊緣，轉化細胞與正常細胞界限分明，形態區別明顯。上皮細胞轉化后形態變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。