中文名稱 英文名稱 規格 保存條件
ELISA 酶標板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 * 4℃/-20℃ #
凍干標準品 Reference Standard 2/1 支* 4℃/-20℃ #
標準品&樣品稀釋液 Reference Standard & Sample Diluent 1 瓶 20mL/12mL * 4℃
濃縮*化抗體 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1 支 120μL/70μL * 4℃/-20℃ #
*化抗體稀釋液 Biotinylated Detection Ab Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
濃縮 HRP 酶結合物 Concentrated HRP Conjugate 1 支 120μL/70μL * 4℃(避光)
酶結合物稀釋液 HRP Conjugate Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
濃縮洗滌液（25×） Concentrated Wash Buffer (25×) 1 瓶 30mL/16mL * 4℃
底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃(避光)
反應終止液 Stop Solution 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
封板覆膜 Plate Sealer 5/3 張*
產品說明書 Product Description 1 份
質檢報告 Certificate of Analysis 1 份
特別說明：
*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）
#: 一周內使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.
相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！
 
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗豚鼠IL-12抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品
中的豚鼠IL-12會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入*化的抗豚鼠IL-12抗體和
辣根過氧化物酶標記的親和素。抗豚鼠IL-12抗體與結合在包被抗體上的豚鼠IL-12結合、*
與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根
過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，IL-12
濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中IL-12的濃度。
 

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樣品收集:
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會
影響測量結果），稱重后將*碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組
織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測。
4. 細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測
具體處理方法可參考：
6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。
7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先
做預實驗，以確定稀釋倍數）。
 
試驗所需自備物品:
1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
 
檢測前準備工作:
1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結
晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為1000pg/mL）。
然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為
空白孔0pg/mL。如配制500pg/mL標準品：取0.5mL1000pg/mL的上述標準品加入含有0.5mL
標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 
 
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4. *化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以*化抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗體(1:100)成工作
濃度。當日使用。
5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。
標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據實際用量來稀釋，如200μL/管）
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube
 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 0 pg/mL
 
洗滌方法:
1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。
 
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次
實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入*化抗體工作液 100μL（在使用前 15 分鐘
內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。
3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內液體拍干。
4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。
5. 棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據實際顯色情
 
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況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。
7. 每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液
的加入順序相同。
8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀
器，設置好檢測程序。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。
 
注意事項：
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染，否則可能會出現錯誤的結果。
2. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成
任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！
3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的
“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在
10分鐘內。推薦設置復孔。
4. 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標
板處于干燥狀態；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
5. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸
水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較
小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、*化抗
體工作液、酶結合物工作液請根據所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請
配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection
Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋
過的標準品、*化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次
用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。
7. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數。
8. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
9. 混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗室安全防護條例執行。
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）
12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！
 
 
6th Edition, revised in June, 2014
 
結果判斷:
1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準
品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度
為縱坐標，繪出標準曲線。
2. 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，
由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程
式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
 
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:
●靈敏度：zui小可測 9.375pg/mL。
●檢測范圍：15.625–1000pg/mL。
● 特異性：可檢測重組或天然的豚鼠 IL-12，且與其它相關蛋白無交叉反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。
 
操作概要
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘
2. 倒去孔內液體，加入 100μL *化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘
3. 洗滌 3 次
4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘
5. 洗滌 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右
7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值
8. 結果計算 
 
 
6th Edition, revised in June, 2014
 
問題分析
若實驗效果不好，請及時對顯色結果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后
我公司為您解決問題。同時您也可以參考以下資料：
問題描述 可能原因 相應對策
標準曲線梯
度差
吸液或加液不準 檢查移液器及吸頭
標準品稀釋不正確 溶解標準品時稍微旋轉瓶身，輕輕混勻使粉末*溶解
洗滌不* 保證洗滌時間和洗滌次數及每孔的加液量
顯色很弱或
無色
孵育時間太短 保證充足的孵育時間
實驗溫度不正確 使用推薦的實驗溫度
試劑體積不夠或漏加
檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加
稀釋不正確
讀數數值低 酶標儀設置不正確
在酶標儀上檢查波長及濾光片設置
提前打開酶標儀預熱
變異系數大 加液不正確 檢查加液情況
背景值高
檢測抗體的工作濃度
過高
使用推薦的稀釋倍數
酶標板洗滌不*
重新閱讀操作手冊，保證清洗*；如果用自動洗板機，
請檢查所有的出口是否有堵塞
洗液有污染 配制新鮮的洗液
靈敏度低
ELISA 試劑盒保存
不當
按說明書要求保存相關試劑
讀數前未終止 OD 讀數前應在每孔中加入終止液
 
聲明
1. 限于現有條件及科學技術水平，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析，本產品可能存
在一定的質量技術風險。
2. zui終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請
務必準備充足的待測樣品。
3. 只有全部使用試劑盒內的試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴
格遵守 Elabscience 的實驗說明才會得到*的檢測結果。
4. 有效期：6 個月。