本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測試的抗原具有二價以上的特性，
能識別包被抗體，同時能識別檢測抗體，具體過程如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質，并用
無關蛋白封閉空余結合位點。
（2）加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體
結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（3）加*標記抗體，使固相免疫復合物上的抗原與*標記抗體結合。*洗滌未
結合的*標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（4）加辣根過氧化物酶標記親和素，使*標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結
合。*洗滌未結合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（5）加入底物顯色，即可計算標本濃度。
（6）注：一個抗體分子上可以標記上若干個*分子，一個*分子可以結合一個辣
根過氧化物酶標記的親和素，從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結合到抗體上，比傳統的直
接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。
【魚 GnRH 酶聯免疫試劑盒檢測原理】
本實驗采用雙抗體夾心 ELISA 法。所提供的 ELISA Kit 是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定
試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為抗魚 GnRH 單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，
經*（biotin）標記。樣品和*標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS 或 TBS 洗
滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過 PBS 或 TBS 的*洗滌后用底物 TMB
顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色
的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
【魚 GnRH 酶聯免疫試劑盒檢測原理示意圖】
*步
第二部
第三步
第四步
【試劑盒組成】
名稱 96 Tests
48 Tests
保存條件
1．魚 GnRH 抗體包被板條
8×12
8×6
4/-20℃
2．魚 GnRH 標準品
2 支（凍干） 1 支（凍干）
4/-20℃
3．濃縮*化魚 GnRH 抗體
1 支
1 支
4/-20℃
4．濃縮酶結合物(ABC)
1 支
1 支
4/-20℃
5. 酶結合物(ABC)稀釋液 1 瓶 1 瓶 4/-20℃
6．抗體稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
7．標準品稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
8．樣品稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
9．濃縮洗滌液
1 瓶（25×）
1 瓶（25×）
4/-20℃
10．顯色劑 A
1 瓶
1 瓶 (避光)
4/-20℃
11．顯色劑 B
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
12．終止液
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
13．說明書
1 份 1 份
室溫
【試驗所需自備試驗設備和器材】
1.
酶標儀(450nm 檢測波長濾光片，570nm 或 630nm 校正波長濾光片) 。
2.
洗板機（可調注液量，保證每孔 350μl 洗液而不溢出）。
3.
超凈工作臺，生物安全柜，通風柜。
4.
高精度單道加液器（量程為 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5.
高精度多道加液器（8 道或 12 道，量程為 50-300μl).
6.
37℃恒溫箱。
7.
低溫離心機。
8.
電冰箱（4
,
℃ -20
,
℃ -86℃）.
9.
分析天平。
10. 剪刀，鑷子，鉗子等。
11. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。
【試驗所需自備試驗耗材及試劑】
1.
離心管（容量為 1.5ml，5ml 等）。
2.
一次性吸頭（量程為 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
3.
純凈水或蒸餾水。
4.
坐標紙。
5.
吸水紙。
6.
EDTA，*，肝素
【標本收集注意事項】
1.
收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2.
血清和血漿避免使用溶血，高血脂標本。
3.
標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4.
標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內，避免
反復凍融。
5.
可根據標本的實際情況，做適當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數) 。
6.
收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤
實驗進程。
7.
收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，口罩，護目鏡等），認為所有標本都具
有一定的潛在危險性。
8.
樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。
【標本處理辦法】
1.
血清：將采集的全血靜置冰箱 4℃過夜，然后 1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即
測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
2.
血漿：用 EDTA，*，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm 離
心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）
保存。
3.
組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS 中過洗一次；按照 1G 組織加入 5-10ml 組織蛋白萃
取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm 離心 10 分鐘，取上清立
即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
4.
細胞培養上清：1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃
（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
5.
尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以
放入-20℃（1-3 個月）或-80
3
℃ -6 個月）保存。
注：樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關文獻了解標本內待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣
品中待測因子的濃度處于 ELISA 試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。
【注意事項】
1．試劑盒使用前請保存在 2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結。
2．濃縮*化魚 GnRH 抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會
使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或 1000rpm 離心 1 分鐘，以使附著管壁
或瓶蓋的液體沉積到管底。
3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結晶*溶解后再配
制洗滌液。
4．測試過程中，魚 GnRH 凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解
兩小時候后，會迅速失活。
5．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
6．配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑，充分混勻對測試結果尤為重
要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標
板 1 分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻。
7．實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規范操作，并在使用前充分預熱。
8．酶免試驗中魚 GnRH 標準品和樣本檢測時建議作復孔。
9．將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置 2-8℃保存。
10．顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
11．超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中。
12．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為 450nm
和 630nm.
13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為 2M 硫酸，使用
時必須注意安全。
14．各步驟加樣均應使用加樣器，并經常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時
間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
15．每次試驗測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本
OD 值大于標準品孔zui高濃度的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，
計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n）。
16．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
17．以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于 350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板
時, 用帶紙屑的吸水材料應慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發生
反應。
18．用終止液終止反應后，請于 10 分鐘內讀取 OD 值。
19．進行復孔實驗時，結果計算一定要求平均值。
20．標本溶血可能會有假陽性結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
21．試驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內，并保持濕度約 60%左右。
22．為保證恒溫箱內的溫度為 37℃，恒溫箱的溫度要經常校準。以確保實驗溫度保持
恒定。
23．48T 的試劑盒，所有組分均為 96T 的 50%的量。
24．如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
【檢測前準備工作】
1. 請提前 20 分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。
3. 魚 GnRH 標準品: 加入標準品稀釋液 1.0ml 至凍干魚 GnRH 標準品中，靜置 10 分鐘，待
其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為 1000 pg/ml)，之后在管身標注①，然后根據需要進行稀釋。
(建議標準曲線使用以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml)。 注意：務
必要保證凍干標準品*溶解和混勻。
4. 標準品稀釋方法圖例： 取 7 支潔凈的試劑管，分別標注
,
,
,
,
,
,
.
② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
每管加入
300μl 標準品稀釋液。從第①管內取出 300μl 加入到第②管，混勻后，再從第②管取出 300μl
加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。
注：復溶標準品原液（1000 pg/ml）請廢棄，不可重復使用。
5.*化魚 GnRH 抗體工作液：按當次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗
體(1:100)，配置成*化抗體工作液。使用前 30 分鐘準備。僅供當日使用。
6.酶結合物工作液：按當次試驗所需要用量，用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100)，
配置成酶結合物工作液。使用前 30 分鐘準備。僅供當日使用。
7.TMB 顯色工作液：在使用之前 30 分鐘，按 TMB 顯色液 A 9 份加 TMB 顯色液 B 1 份（9：
1）的比例配制 TMB 顯色工作液。
【洗滌方法】
1．自動洗板機：要求注入的洗滌液為 350μl，注入與吸出間隔 20－30 秒。確保機器運用熟
練后，再投入實驗中使用。
2．手工洗板：每孔加洗滌液 350μl，靜置 30 秒后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干。手工洗
板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現跳孔的現象。
【操作步驟】
1.
從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內封
存于 2-8℃。
2.
預留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設）。
3.
分別將標本或不同濃度魚 GnRH 標準品（0pg/ml 孔加標準品稀釋液）加入相應孔中
(100μl/孔)，用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育 90 分鐘。
4.
提前 30 分鐘制備*化魚 GnRH 抗體工作液。
5.
洗板 3 次。
6.
加入*化魚 GnRH 抗體工作液(100μl/孔)。用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育
60 分鐘。
7.
提前 30 分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置。
8.
洗板 3 次。
9.
除空白孔外，加入酶結合物工作液(100μl/孔)。用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱，避
光孵育 30 分鐘。
10. 洗板 5 次。
11. 加入 TMB 顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當標準曲線高
濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應請勿超過 30 分
鐘。
12. 加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測量 OD（450nm）值(10 分鐘內)。
【結果判斷】
1．每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值。（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相
交于 Y 軸）
2．手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD 值作縱坐標，以平滑線連接各標準品
的坐標點。通過標本的 OD 值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業制作曲線軟件進行
分析，如 curve expert 1.3 進行結果計算。
3．若標本 OD 值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
【參考曲線】
注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。
【操作程序總結】
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品，37℃反應 90 分鐘
洗板 2 次，加入*化抗體工作液，37℃反應 60 分鐘
洗板 3 次，加入 ABC 工作液，37℃反應 30 分鐘
洗板 5 次，加入 TMB 顯色液，37℃反應
加入 TMB 終止液
10 分鐘之內酶標儀測 OD 值
計算標本待測因子含量
試劑盒參數
【檢測范圍】1000pg/ml-15.6pg/ml
【靈敏度】zui小可測魚 GnRH 達 5pg/ml.
【特異性】系統和其它因子無交叉反應。
【批間差】≤12%.
【批內差】≤8%.
【回收率】70-110%.
【保存】-20
[
℃ 短期內（如兩周）可 4
]
℃
【用途】用于體外定量分析液體標本（通用型）。
【規格】96T.
【生產日期】見酶標板鋁箔袋封口鋼印。
【有效期】12 個月（-20℃）.