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上海哈靈生物科技有限公司
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土壤脫氫酶試劑盒操作方式
2021-5-4 閱讀(562)
土壤脫氫酶（Soil dehydrogenase, sDHA）試劑盒說明書
（分光光度法 50 管/48 樣）
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
土壤脫氫酶(Soil dehydrogenase, sDHA)的活性可以反映土壤體系內活性微生物量以及其對有機物的降解活性，可以作為土壤微生物的降解性能指標。
測定原理：
氫受體 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在細胞呼吸過程中接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈現紅色，在波長 485nm 處有大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 測定其吸光值，即得土壤脫氫酶活性。
自備實驗儀器及用品：
篩子、天平、恒溫培養箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計、玻璃比色皿，冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。
試劑的組成和配制：
試劑一：粉劑×1 瓶，使用前加 10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現配現用）。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：自備甲醇。
試劑四：200μg/mL標準液1mL×1 支，4℃避光保存。
樣品處理：
新鮮土樣自然風干或者37℃烘箱烘干，過30-50目篩
測定步驟和操作表：
測定管 空白管 標準管
土樣（g） 0.1
標準液（μL） 200
試劑一應用液（μL） 200 200
試劑二（μL） 200
充分混勻，37℃，暗培養 24h（標準管無需反應24h，可在測定、空白管暗培養24h后再測）
甲醇（μL） 1800 1800 1600
避光反復震蕩1小時，8000g，離心 5min，取上清 1mL 于 1mL光徑玻璃比色皿，測定A485。空白只要做1管。
（標準管用于制作標準曲線，參考附錄I）
酶活單位定義：在 37℃時，每克土壤樣品每天催化產生 1μg TF 為一個酶活性單位。
脫氫酶活力計算：
注意事項：
1. 配制好的試劑一避光保存于 4℃，在一周內使用，若出現紅色，則不能使用。
2. 試劑三易揮發，有毒，為了您的健康，請穿實驗服，戴，戴乳膠手套操作。
附錄I：標準曲線的制作
一、操作表：
標準管 S0 S1 S2 S3 S4
200μg/mL標準液（μL） 0 50 100 150 200
試劑二（μL） 200 200 200 200 200
甲醇（μL） 1800 1750 1700 1650 1600
避光反復震蕩1小時，1mL光徑玻璃比色皿，測定A485
相當于標準液濃度（μg/L） 0 5 10 15 20
注：標準液初始濃度為200μg/mL，因其為主要呈色物質，體系中的其他試劑只是對其起到了稀釋作用，故終反應完反應液中標準濃度為（200μg/mL÷（各管反應體系總體積÷各管加入200μg/mL標準液體積））。
二、結果：
標準管號 S0 S1 S2 S3 S4
OD值 0.005 0.238 0.473 0.69 0.952
OD值 0 0.233 0.468 0.685 0.947
相當于標準液濃度（μg/L） 0 5 10 15 20
